X

Ta strona używa ciasteczek (cookies) w celu zapewnienia najwyższej jakości usług. Korzystając ze strony, wyrażasz zgodę na ich używanie zgodnie z aktualnymi ustawieniami przeglądarki.

Dlaczego badania genetyczne w niepłodności są konieczne?

dodano: 2011-05-08 08:57:00

Prof.dr hab.med. Anna Latos-Bieleńska

 

Dlaczego badania genetyczne w niepłodności są konieczne?

 

 

  1. 1.      Wstęp –  czy niepłodność może być problemem genetycznym?

 

W przypadku niepłodności badania genetyczne są niezbędną częścią postępowania diagnostycznego, ponieważ u co najmniej 30% niepłodnych par przyczyną niepłodności jest czynnik genetyczny [6, 16].

Badania genetyczne mają na celu nie tylko ustalenie przyczyny niepłodności, ale także stwierdzenie, czy przyczyną braku ciąży nie są zmiany materiału genetycznego u jednego lub obojga partnerów, które mogą prowadzić do ciężkich chorób genetycznych u dziecka.

U par, u których stwierdzono czynnik genetyczny metody wspomaganego rozrodu mogą być skuteczne, ale może dojść do przekazania nieprawidłowego materiału genetycznego potomstwu. Skutki tego mogą być różne: wystąpienie u potomstwa tych samych problemów z rozrodem jakie występowały u rodzica i/lub podwyższone ryzyko urodzenia dziecka z chorobą genetyczną (najczęściej związaną z wadami wrodzonymi i/lub niepełnosprawnością intelektualną). W poradni genetycznej pary uzyskują pełną informację na ten temat i na tej podstawie mogą świadomie kształtować swoje plany prokreacyjne.

Ostatnie lata przyniosły znaczny postęp w badaniach molekularnych przyczyn niepłodności. Zidentyfikowano wiele genów, co do których są przesłanki na podstawie funkcji albo z badań na modelu zwierzęcym, że ich mutacje mogą prowadzić do niepłodności [8, 9, 10, 15]. Interesujący i ważny kierunek badań to analiza wybranych genów podlegających rodzicielskiemu piętnowaniu genomowemu (imprinting). Rodzicielskie piętnowanie genomowe polega na tym, że część genów człowieka „pamięta”, od którego z rodziców pochodzi. Odbywa się to poprzez metylację DNA. Zaburzenia imprintingu mogą tłumaczyć podwyższone ryzyko wystąpienia u dziecka poczętego zwłaszcza z zastosowaniem ICSI,  niektórych zespołów związanych z zaburzeniami rodzicielskiego piętnowania genomowego, jak Beckwith-Wiedemann czy Silver-Russell [11].

 

2. Konsultacja genetyczna w niepłodności - na czym polega?

 

Badania genetyczne powinny być poprzedzone konsultacją genetyczną, przy czym jest bardzo ważna sprawą, żeby do poradni genetycznej zgłosiła się para, a nie tylko to z partnerów, u którego jest podejrzenie, że przyczyna  niepłodności leży po jego stronie.

 

W przypadku pary z niepłodnością diagnostyka genetyczna i poradnictwo genetyczne obejmują następujące elementy:

- Wywiad dotyczący stanu zdrowia obojga partnerów, stanu ginekologicznego, zapoznanie się z wynikami badania nasienia.

- Zebranie informacji o ew. narażeniu na czynniki szkodliwe związane z wykonywaną pracą zawodową, używkami itp.

- Ocena fenotypu obojga partnerów ze zwróceniem uwagi na ew. objawy chorób genetycznych.

- Wywiad rodzinny w zakresie co najmniej 3 pokoleń, wykreślenie i analiza rodowodu; wywiad dotyczy przypadków chorób genetycznych, wad wrodzonych, upośledzenia umysłowego i niepowodzeń rozrodu w rodzinie.

- Badanie kariotypu u obojga partnerów na podstawie limfocytów krwi obwodowej, w miarę potrzeby uzupełnione o metody cytogenetyki molekularnej.

- Badania molekularne – nie w każdym przypadku, dobiera się je indywidualnie (w przypadku oligozoospermii badanie CFTR i AZF u mężczyzny; w przypadku POF badanie FMR1 u kobiety; inne badania molekularne w zależności od fenotypu)

- Indywidualna interpretacja wyników w kontekście sytuacji klinicznej, danych z analizy rodowodu i bieżącego piśmiennictwa światowego.

- Przedstawienie parze wyników badań, udzielenie porady genetycznej, wydanie karty informacyjnej.  

Wymienione postępowanie diagnostyczne (konsultacja genetyczna i badania genetyczne) są również obowiązującym standardem w przygotowaniu pary do wspomaganego rozrodu

 

3. Jakie metody badań genetycznych znajdują zastosowanie u par z niepłodnością?

 

- Badanie kariotypu

Jest to badanie, od którego należy rozpocząć diagnostykę genetyczną. Badanie wykonuje się metodami cytogenetyki klasycznej, a materiałem do badań jest krew obwodowa (2-3 ml krwi pobranej na heparynę do fabrycznie przygotowanych probówek). Krwi na badanie kariotypu nie należy zamrażać, można ją transportować lub przesyłać szybką pocztą bez konieczności zabezpieczenia szczególnych warunków  [1]. Cytogenetyk liczy chromosomy, analizuje ich wzór prążkowy i na tej podstawie stwierdza, czy nie występują zmiany w liczbie lub strukturze chromosomów.

Niekiedy ważnym uzupełnieniem badania cytogenetycznego wykonanego z zastosowaniem metod cytogenetyki klasycznej jest FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ). FISH wykonuje się, kiedy wyniki badania kariotypu nie są jednoznaczne, jest podejrzenie specyficznych mikrorearanżacji materiału genetycznego lub jest podejrzenie mozaikowatości [2, 14]. Są to rzadkie sytuacje. W FISH odpowiednio dobrane i wyznakowane fluorochromami sondy molekularne zostają nałożone na preparat cytogenetyczny, hybrydyzują specyficznie do chromosomów i miejsce hybrydyzacji obserwuje się w mikroskopie fluorescencyjnym.

 

- Badania molekularne w diagnostyce genetycznej niepłodności

Badania molekularne mogą niekiedy zastąpić FISH w przypadku podejrzenia submikroskopowej aberracji niezrównoważonej (mikrodelecji lub mikroduplikacji), ale przede wszystkim stosuje się je w przypadku podejrzenia niepłodności spowodowanej mutacjami genowymi [17, 18]. W większości badań molekularnych stosuje się PCR (w tym tzw. multiplex PCR) i sekwencjonowanie, niekiedy także MLPA.

Dla przeprowadzenia badań molekularnych wymagana jest pisemna zgoda pacjenta. Materiałem do badań jest najczęściej niewielka ilość (2-5 ml) krwi obwodowej pobranej do probówki z antykoagulantem (np. wersenian sodu - EDTA). Tak pobraną krew można przesyłać pocztą, można też zamrozić i przechowywać przez dłuższy czas. Wiele badań molekularnych można obecnie wykonywać na podstawie kropli krwi (pobranej na specjalną bibułę), a nawet na podstawie wymazu z błony śluzowej wewnętrznej strony policzka. Rodzaj materiału biologicznego i sposób pobrania należy uzgodnić z laboratorium wykonującym badanie genetyczne.

 

- Technologia mikromacierzy w diagnostyce genetycznej niepłodności 

Technologia mikromacierzy typu Array-CGH umożliwia wykrycie niezrównoważonych zmian genomowych. Sprawa jej znaczenia w diagnostyce niepłodności jest otwarta, już poznane mikrodelecje związane z niepłodnością mogą być diagnozowane innymi, tańszymi metodami, jednak w miarę gromadzenia wyników badań odkrywa się znaczenie mikrorearanżacji genomowych w patologii człowieka. Już obecnie wiadomo, że badania z zastosowaniem mikromacierzy wykrywają nosicielstwo niezrównoważonych mikrorearanżacji materiału genetycznego także u osób bez widocznych zmian w fenotypie i niektóre z tych zmian mogą mieć związek z niepłodnością. Ponadto w miarę postępów w poznawaniu molekularnego podłoża niepłodności jednogenowego i wielogenowego, można przewidywać szerokie zastosowanie w genetycznej diagnostyce niepłodności technologii mikromacierzy opartej na SNP [7]. Do badań metodą mikromacierzy pobiera się krew tak jak do innych badań molekularnych.

 

4. Jakie zmiany materiału genetycznego wykrywa się u par z niepłodnością i co to oznacza dla planów prokreacyjnych?

 

Najczęściej wykrywaną zmianą genetyczną u par z niepłodnością są aberracje chromosomowe. U kobiet jest to zespół Turnera (1/2500 żywo urodzonych dziewczynek). Kobiety z zespołem Turnera mają niski wzrost, charakterystyczne cechy dysmorficzne i pierwotny brak miesiączki spowodowany tym, że w miejscu gonad występują pasma tkanki łącznej. Kobiety z zespołem Turnera mają tylko jeden prawidłowy chromosom X, a drugi chromosom X jest nieobecny (50% przypadków) albo ma zmienioną strukturę (najczęściej izochromosom ramion długich), mogą też występować kariotypy mozaikowe z udziałem prawidłowej linii komórkowej 46,XX. Przy kariotypie mozaikowym może być zachowana płodność, lecz dochodzi do POF (przedwczesne wygasanie czynności jajnikow), ponadto mają one podwyższone ryzyko urodzenia córki z zespołem Turnera (także duże ryzyko poronień, ponieważ 99% zarodków i płodów z kariotypem 45,X ulega poronieniu). Opisywano ciąże u kobiet z zespołem Turnera przy kariotypie 45,X z zastosowaniem IVF, ale w tych przypadkach należy skorzystać z komórki jajowej pochodzącej od dawczyni [6].   

Nawet w przypadku silnych przesłanek, że przyczyna niepłodności leży po stronie mężczyzny, zawsze należy także określić kariotyp kobiety, ponieważ wykazano, że partnerki niepłodnych mężczyzn - częściej niż ogólna populacja kobiet - mają aberracje chromosomowe (translokacje wzajemne i robertsonowskie, inwersje). Obserwowano to także w badaniach własnych.

Aberracje chromosomowe są także najczęstszą genetyczną przyczyną niepłodności męskiej: wykrywa się je u 13,2% mężczyzn z azoospermią, 4,3% z oligozoospermią i 3% niepłodnych mężczyzn z normozoospermią [za 19].

Podobnie jak u niepłodnych kobiet, tak samo u niepłodnych mężczyzn przeważają aberracje chromosomów płci: X i Y (ok. 4% niepłodnych mężczyzn ma taką aberrację). Dodatkowy chromosom X u mężczyzny (kariotyp 47,XXY - zespół Klinefeltera) stwierdza się u 10% mężczyzn z azoospermią i  0,5% mężczyzn z oligozoospermią. U mężczyzn z kariotypem 47,XXY opisywano  prawidłowe genetycznie potomstwo po zastosowaniu ICSI z użyciem komórek rozrodczych uzyskanych po biopsji jadra, jednak odnotowano również podwyższone ryzyko wystąpienia u potomstwa aneuploidii chromosomów płci i autosomów [6]. Rzadziej przyczyną niepłodności męskiej jest dodatkowy chromosom Y (0,3% mężczyzn z oligozoospermią, kariotyp 47,XYY), czy translokacje między X lub Y a chromosomem autosomalnym. Natomiast u 0,9% mężczyzn z azoospermią stwierdza się kariotyp 46,XX z obecnością submikroskopowej translokacji fragmentu chromosomu Y zawierającego gen SRY. U niepłodnych mężczyzn występują też kariotypy mozaikowe (oprócz linii komórkowej z kariotypem 46,XY występuje linia komórkowa z nieprawidłową liczbą lub strukturą chromosomów płci) [6, za 19]. 

Również aberracje chromosomów autosomalnych mogą być przyczyna niepłodności męskiej, jednak z reguły nie występuje wówczas azoospermia, ale oligozoospermia lub nawet normospermia. Wśród niepłodnych mężczyzn z normozoospermią u 1,6% stwierdza się aberracje dotyczące chromosomów autosomalnych a wśród tych z oligozoospermią – u ok. 3%, z tego połowa to translokacje robertsonowskie (najczęściej 13;14), w pozostałych przypadkach translokacje wzajemne, inwersje i chromosomy markerowe [za 19].

Wykrycie nosicielstwa aberracji chromosomów autosomalnych u któregokolwiek z partnerów może poważnie skomplikować plany prokreacyjne takiej pary. Nosicielstwo translokacji robertsonowskich i wzajemnych wprawdzie zwykle nie przekreśla szansy na posiadanie zupełnie zdrowego potomstwa, jednak oznacza podwyższone ryzyko poronień samoistnych, co u pary, która musi korzystać z IVF jest dużym problemem.  Takie nosicielstwo związane jest zwykle również z podwyższonym ryzykiem urodzenia dziecka z zespołem wad i opóźnieniem rozwoju. Dla nosicielstwa translokacji robertsonowskich są dość dokładne dane dotyczące ryzyka niezrównoważonego kariotypu u potomstwa, natomiast w przypadku translokacji wzajemnych i inwersji ryzyko genetyczne jest określane indywidualnie i zależy od tego, które chromosomy są objęte aberracją oraz wielkości fragmentów chromosomów zaangażowanych w aberrację [4, 6, 12, 13].  

Około 10-15% mężczyzn z prawidłowym kariotypem i azoospermią lub ciężką oligozoospermią ma mikrodelecje w AZF (azoospermic factor) w Yq11.2. Najczęściej jest to mikrodelecja AZFc, przy której występują różnorodne zaburzenia spermatogenezy, ale w większości przypadków jest obecność plemników w nasieniu. Całkowita delecja AZFa lub AZFb prowadzi odpowiednio do zespołu samych komórek Sertoliego lub zaburzeń w dojrzewaniu spermatocytów, podczas gdy częściowe delecje są związane z łagodniejszymi skutkami fenotypowymi i często obecnością plemników w ejakulacie [5].  Mężczyźni z mikrodelecjami w locus AZF przekażą te mikrodelecję wszystkim synom, są też doniesienia o podwyższonym ryzyku wystąpienia u potomstwa monosomii X [za 6]. 

 

Niekiedy u niepłodnych mężczyzn występuje tzw. azoospermia obstrukcyjna spowodowana wrodzonym obustronnym brakiem nasieniowodów (CBAVD). U takich mężczyzn konieczna jest analiza genu CFTR, ponieważ aż 70% mężczyzn z CBAVD ma mutacje w obydwu allelach genu CFTR.  Wśród mutacji występuje nie tylko  delF508, najczęstsza mutacja występująca w klasycznej mukowiscydozie, ale także mutacje typowe dla CBAVD, zwłaszcza R117H [6,15]. Jeżeli przyczyną niepłodności męskiej jest mutacja w genie CFTR, są wskazania do badania genu CFTR także u partnerki. W przypadku stwierdzenia nosicielstwa mutacji także u niej, para taka ma ryzyko 25% urodzenia dziecka z mukowiscydozą (typową lub nietypową klinicznie), jeśli mężczyzna jest heterozygotą pod względem mutacji w CFTR, a 50% jeśli jest homozygotą. U mężczyzn z CBAVD należy również wykluczyć wady rozwojowe nerek (jednostronna agenezja) ze względu na podwyższone ryzyko wystąpienia agenezji nerek także u potomstwa [6].

Istnieje wiele innych chorób jednogenowych, w których występuje niepłodność, w tych przypadkach badania molekularne muszą być poprzedzone dokładnym rozpoznaniem klinicznym (np. zespół Kallmanna) i na tej podstawie dobiera się diagnostykę molekularną  [15].

 

Również u kobiet jest wiele chorób jednogenowych związanych z niepłodnością lub z ograniczeniem płodności. Szczególnie u kobiet z POF na uwagę zasługuje możliwość nosicielstwa premutacji w genie FMR1, które występuje w 2% przypadków sporadycznych i 15% przypadków rodzinnych POF [6]. Stwierdzenie premutacji identyfikuje rodzinę podwyższonego ryzyka genetycznego zagrożoną wystąpieniem niepełnosprawności intelektualnej, zwłaszcza u chłopców.

POF może być częścią wielu innych zespołów genetycznych i jest wiele genów, których mutacje mogą powodować POF (np. BMP15, FMR2, LHR, FSHR, INHA, FOXL2, FOXO3, ERα, SF1, ERβ i CYP19A1) [3]. Należy badać te geny, gdyż stwierdzenie nosicielstwa mutacji pozwala na świadome przyspieszenie realizacji planów prokreacyjnych i uniknięcie problemów w prokreacji związanych z POF [3, 6].

 

5. Podsumowanie

 

U par z niepłodnością badania genetyczne są ważnym i niezbędnym elementem postępowania diagnostycznego, ze względu na duże znaczenia czynnika genetycznego w etiologii niepłodności. Wykluczenie lub potwierdzenie genetycznej przyczyny niepłodności ma znaczenie diagnostyczne i prognostyczne.

 

 

Piśmiennictwo

 

  1. Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L. (Eds.): ACT cytogenetics laboratory manual. Wyd. III. Lippincott-Raven Publishers (Philadelphia) 1997.
  2. Barratt CL, Aitken RJ, Björndahl L, i wsp.: Organization, protection and vulnerability: from basic science to clinical applications - a position report.  Hum Reprod. 25(4):824-38, 2010.
  3. Budny B., Kanik M., Latos-Bieleńska A.: Fluorescence in situ hybridization (FISH) - application in research and diagnostics. Folia Histochemica et Cytobiologica, 40:107-108, 2002.
  4. Carrell DT, Aston KI. The search for SNPs, CNVs, and epigenetic variants associated with the complex disease of male infertility. Syst Biol Reprod Med. 57(1-2):17-26, 2011.
  5. Cordts EB, Christofolini DM, Dos Santos AA i wsp.: Genetic aspects of premature ovarian failure: a literature review. Arch Gynecol Obstet. 283, 635-43, 2011. 
  6. El Hajj N, Zechner U, Schneider E i wsp.: Methylation Status of Imprinted Genes and Repetitive Elements in Sperm DNA from Infertile Males. Sex Dev. 2011.
  7. Engels H., Eggermann T., Caliebe A. i wsp.: Genetic counseling in Robertsonian translocations der(13;14): frequencies of reproductive outcomes and infertility in 101 pedigrees. Am.J.Med.Genet. 146A, 2611-16, 2008.  
  8. Ferlin, A., Arredi, B., Speltra, E. i wsp.: Molecular and clinical characterization of Y chromosome microdeletions in infertile men: a 10-year experience in Italy. J. Clin. Endocr. Metab. 92: 762-770, 2007.
  9. Firth H.V., Hurst J.A., Hall J.G.: Oxford Desk Reference: Clinical Genetics. Oxford University Press, Oxford 2006.
  10. Fruhman G, Van den Veyver IB. Applications of array comparative genomic hybridization in obstetrics. Obstet Gynecol Clin North Applications of array comparative genomic hybridization in obstetrics. 37:71-85, 2010.
  11. Garrido N, Martínez-Conejero JA, Jauregui J, i wsp.: Microarray analysis in sperm from fertile and infertile men without basic sperm analysis abnormalities reveals a significantly different transcriptome. Fertil Steril. 91(4 Suppl):1307-10, 2009.
  12. Hammoud SS, Purwar J, Pflueger C i wsp.: Alterations in sperm DNA methylation patterns at imprinted loci in two classes of infertility. Fertil Steril. 94(5):1728-33, 2010.
  13. Kusz K, Ginter-Matuszewska B, Ziolkowska K i wsp. Polymorphisms of the human PUMILIO2 gene and male sterility. Mol Reprod Dev. 74(6):795-9, 2007.
  14. Kusz K, Tomczyk L, Spik A i wsp.: NANOS3 gene mutations in men with isolated sterility phenotype. Mol Reprod Dev. 76(9):804, 2009.
  15. Kusz KM, Tomczyk L, Sajek M i wsp.: The highly conserved NANOS2 protein: testis-specific expression and significance for the human male reproduction. Mol Hum Reprod. 15:165-71, 2009.
  16. Marques CJ, Francisco T, Sousa S i wsp.: Methylation defects of imprinted genes in human testicular spermatozoa. Fertil Steril. 94(2):585-94, 2010.
  17. Midro A.T., Stengel-Rutkowski S., Stene J.: Experiences with risk estimates for carriers of chromosomal reciprocal translocations. Clin Genet. 41(3), 113-22, 1992.
  18. Midro A.T., Wiland E., Panasiuk B. i wsp.: Risk evaluation of carriers with chromosome reciprocal translocation t(7;13)(q34;q13) and concomitant meiotic segregation analyzed by FISH on ejaculated spermatozoa. Am. J. Med. Genet. A. 140(3), 245-56, 2006.
  19. Monfort S., Martinez F., Rosello M. i wsp.: A subtelomeric translocation apparently implied in multiple abortions. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 23(2), 97-101, 2006.
  20. OMIM – Online Mendelian Inheritance in Men. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim
  21. Poongothai J, Gopenath TS, Manonayaki S: Genetics of human male infertility. Singapore Med. J. 50(4), 336-347, 2009.
  22. Poplinski A, Tüttelmann F, Kanber D i wsp.: Idiopathic male infertility is strongly associated with aberrant methylation of MEST and IGF2/H19 ICR1. Int J Androl. 33(4):642-9, 2010.
  23. Slater H.R., Bruno D.L., Ren H. i wsp.: Rapid, high throughput prenatal detection of aneuploidy usung a novel quantitative method (MLPA). J.Med.Genet. 40(12), 907-912, 2003.
  24. Stankiewicz P., Lupski J.R.: Structural variation in the human genome and its role in disease. Annu. Rev. Med. 61, 437-455, 2010.
  25. Tempest HG. Meiotic recombination errors, the origin of sperm aneuploidy and clinical recommendations. Syst Biol Reprod Med. 57(1-2):93-101, 2011.
  26. Wiland E. Badania cytogenetyczne plemników i komórek somatycznych mężczyzn z niepowodzeniami rozrodu. Nowiny Lekarskie. Supl. 1, 2010.